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人类基因组计划的完成, 开启了生物组学研究的大门。然而，复杂生物系统的细胞异质性阻碍了该领域的深入发展。单细胞技术为生物组学研究开辟了新的方向——单细胞组学。本文由国内外20个单位24位学者综述了单细胞技术的发展历程、关键技术和重要应用，展望了单细胞多组学和空间组学技术的挑战与机遇。


图1 单细胞实验与计算技术在肿瘤、辅助生殖、发育、育种、空间组学和多组学中的应用


单细胞技术通过分离单细胞进行测序，可以分析组织中存在的细胞类型，鉴定细胞的状态，研究细胞间的异质性，通过单细胞水平的基因表达变化揭示分化发育、疾病发生发展、肿瘤耐药等分子机制。单细胞转录组测序技术在2009年被首次报道，随后出现了一系列单细胞其它组学的测序技术和单细胞多组学同时测量的技术（图2）。








单细胞实验技术
日新月异的单细胞实验技术正将表型分析深入到单细胞水平，未来与组学技术的深入结合值得期待。
单细胞表面功能化：从大自然中生命体的自我保护现象得到启发，单细胞表面功能化技术可以将无生命的材料与单细胞结合，在增强细胞活性和稳定性的同时，精准赋予单细胞多种功能，在环境，能源，医疗和催化等领域得到了广泛应用。其中，动态壳层技术，如自修复壳层技术和可逆壳层技术，能够控制细胞表面壳层来适应细胞各种应用环境，是单细胞表面功能化技术的最新发展方向（图3）。如何将无生命的材料适应增殖中的单细胞并形成即时细胞功能化，是未来的发展趋势。
图3 单细胞检测方法示意图和单细胞内电生理检测
单细胞内电生理检测：对单个电生细胞高保真电生理信号进行记录，有助于加深我们对单细胞行为的理解。膜片钳技术是检测细胞离子通道最直接有效的方法，它目前仍是细胞动作电位和离子通道检测的黄金标准。开发具有纳米级记录元件的细胞内电生理记录工具可以在降低侵入性的同时提高时空分辨率的极限，该记录工具不仅可以更深入地了解单细胞到组织水平的产电细胞，也为在亚细胞和分子水平的电生理学研究提供更多的定量参数。
液滴微流控单细胞测序技术：有效的单细胞分离技术促进了许多商业化的高通量单细胞测序平台的发展。早期的平台大多使用多孔板，利用手动，细胞分选仪或者机器人将单个细胞分别加入多孔板的单个孔中，同时在每个孔中加入带条码的引物和试剂，用于随后的扩增和测序。而新一代的测序平台（比如MobiGaea）利用微流控技术，能高效地将单个细胞以及引物和试剂同时包裹在成千上万的液滴里，并在液滴里进行扩增，从而真正一步实现高效的单细胞测序（图4）。这些测序平台也激发了科研工作者的灵感，将单细胞测序更广泛地用于生命科学研究中。
图4 液滴微流控单细胞测序过程










单细胞组学数据分析技术

目前，已经有很多的单细胞组学数据分析工具，最常用的主要是Seurat和Scanpy，基本的分析如图5所示，包括：
质量控制：由于测序细胞数目多，每个细胞的测序数据量相对bulk测序少很多，这就造成部分细胞没有足够数量的基因能够被准确定量，因此需要对细胞进行过滤。除了测量的基因数目，还要考虑线粒体、双胞体、多胞体等因素。如果需要合并多批数据，还要进行批次校正。
聚类和细胞类型注释：使用t-SNE或者UMAP等方法可以根据基因表达将聚类到不同cluster的细胞可视化，但是每个cluster属于什么细胞仍然需要根据marker基因进行细胞类型注释，或者先使用自动注释工具SingleR、CellAssign等进行初步注释，再结合文献进行人工校正。
轨迹推断：可以使用Monocle和RNA velocity等工具推断分化发育轨迹。Monocle基于表达相似性构建分化轨迹，RNA velocity通过区分mRNA分子处于生命周期的不同阶段推断细胞发育路径。
单细胞调控网络：SCENIC和NicheNet等工具可以基于单细胞数据构建调控网络。SCENIC通过构建共表达网络、TF-target网络、计算Regulon活性三步完成转录因子分析。NicheNet通过配体、受体、下游转录因子与靶基因的相互作用，推断细胞状态的潜在调控配体。
细胞通讯：CellphoneDB、CSOmap等工具可以基于配体-受体相互作用，构建细胞-细胞通讯网络，研究不同类型的细胞之间如何进行相互交流。









单细胞技术在肿瘤研究中的应用

近年来，单细胞技术尤其是单细胞测序技术在肿瘤研究和临床中获得广泛应用，主要包括：癌前侵袭的鉴别、原发性肿瘤的克隆进化、肿瘤内异质性(ITH)分析、肿瘤微环境的重编程研究、肿瘤转移和治疗抵抗（耐药性）等。与常规的RNA测序分析相比，单细胞测序技术优势在于：在单细胞水平更容易找出哪种细胞在治疗和预后条件下有差异表达基因；同时重建分化谱系和差异表达亚型，还可以推断描述克隆亚结构、推断克隆谱系、重建肿瘤进化及鉴定突变的共现性或互斥性（图6）。这为进一步破解肿瘤发生机制、探索全新的肿瘤治疗方案提供了机遇。










单细胞技术在辅助生殖领域的应用

近年来，我国辅助生殖技术发展迅速，部分研究领域甚至处于领跑地位。目前，每年人类辅助生殖技术应用的总数超过100万例。随着生育政策的变化，我国高龄怀孕女性的比例明显增加。然而，随着年龄增长，由于女性卵巢功能与卵细胞质量迅速下降，而引发的出生缺陷等不良生育结局的概率也急剧上升。这对辅助生殖技术提出越来越高的要求。通过单细胞测序技术，研究人员可以探索孕妇与胎儿在子宫内的互动，并且捕捉胎儿生长发育中细胞的状态变化和相互作用（图7），为提高辅助生殖技术提供了深刻的生物学见解。目前，单细胞技术虽然成本高昂，但人类胚胎发育所涉及的细胞数目少，使用单细胞技术的成本尚可接受，辅助生殖技术也是单细胞技术最可能应用于临床的领域之一，后续发展值得期待。

图7 单细胞技术在辅助生殖领域的应用










发育生物学中的单细胞测序

单细胞技术在发育生物学研究中尤为重要，被广泛应用于鉴定细胞类型、研究发育变化动态过程和揭示基因调控动态机制（图8）。其主要应用包括：单细胞转录组测序技术绘制胚胎发育转录图谱；单细胞转录组测序技术重构细胞发育路径；发育路径重构算法预测细胞谱系发生轨迹；单细胞测序与空间组学技术结合解析胚胎发育的时空变化。

图8 发育生物学中的单细胞测序










植物中的单细胞测序
植物具有细胞壁，细胞分离困难，相对于动物，单细胞组学在植物中发展相对缓慢。2019年，模式植物拟南芥根中的单细胞转录组学研究揭开了植物单细胞组学的序幕。随后，植物单细胞核提取技术的优化，使得单细胞组学在植物中的应用更进一步，单细胞核转录组及单细胞ATAC-seq随之发展。自此之后，单细胞组学开始在植物中全面展开。植物单细胞组学能够鉴定细胞的异质性，追踪不同类型细胞的发育谱系，从而鉴定调控细胞命运转换的关键基因，为植物发育及后续育种提供导向（图9）。植物单细胞组学依然处在发展的初期，随着空间组学的引入，植物时空单细胞组学将具有更大发展空间。

图9 植物中的单细胞组学










空间组学为细胞组成构建三维地图

细胞是组成生命体的基本单位。科学家们不仅关心细胞的组成类型，更关注不同细胞在组织器官中的空间位置，这是理解组织器官形成、生命体表型和功能的关键。空间组学是在保存细胞空间位置信息的基础上对细胞内核苷酸或蛋白质图谱进行捕获的一类技术，该技术能够有力填补目前单细胞技术不能捕获细胞空间信息的缺陷（图10）。目前，空间组学技术仍处于初始阶段，但发展迅速，前景广阔。未来，空间组学技术的主要突破将体现在单细胞分辨率、多组学捕获、高通量处理等方面。


图10 空间组学为细胞组成构建三维地图










单细胞多组学

中心法则是细胞运行的基本规则，细胞不仅包含RNA，还包含DNA、蛋白质等多种分子，各种分子共同组成了细胞这样一个有机整体。虽然单细胞转录组学技术极大地革新了分子机制研究，但是单一的转录组并不能全面体现细胞的变化。因而单细胞多组学整合分析应运而生。随着单细胞基因组、蛋白质组、代谢组的发展，从全局视角解析单个细胞功能值得期待（图11）。多组学整合手段正逐步在肿瘤、发育、疾病等相关领域大展拳脚。

图11 单细胞多组学
总结与展望
本文深入回顾了单细胞测序技术发展，介绍未来可能影响领域发展的单细胞实验技术，结合单细胞组学数据的分析，归纳目前单细胞技术在肿瘤、辅助生殖、发育、育种等领域的最新应用。越来越多的研究将利用到单细胞技术，单细胞组学也将会源源不断地发现新的细胞类型和新的分子机制，正如同达尔文时代发现新物种和新的进化路径一般。时空组学和单细胞多组学是值得期待的新前沿，希望有越来越多的年轻人加入，推动单细胞新技术、新方法在新领域的应用。






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杨冠军    宁波大学
吴   鹏    苏州科技大学