1930年下半年，中国共产党在内部发动反AB团的肃反运动，大量杀害党内工作人员。1931年1月15日，中共苏区中央局正式成立，由周恩来、毛泽东、项英、任弼时、朱德等组成，周恩来为书记，项英任代理书记，实际掌握权力。
项英将富田事变定性为内部斗争，提出以教育为主来解决党内矛盾的主张，对江西红军和苏区的“肃反”扩大化进行批评，但由于与毛泽东的意见相左受到批评。4月，任弼时来到江西宁都县青圹村，传达政治局决议，项英的苏区中央局代理书记由毛泽东代之，改任军委副主席。
至此，项英与毛泽东的结下了不解之仇。


中共军队内部山头林立，会师陕北的一二四方面军之间矛盾激烈，更不用说还在南方的项英的新四军（图源：维基百科公有领域）
之后，毛泽东逐渐取得红军的指挥权，在国民党围剿中，带领部分红军突出重围，由南方的根据地长征至陕北。留在南方八省进行游击战争的红军和游击队继续进行游击战，项英为主要领导人之一。
1936年底西安事变之后，国共双方达成和解，决定建立抗日民族统一战线。中共南方的军队整编为国民革命军陆军新编第四军，或称国民革命军新编第四军，简称新四军。叶挺为军长，项英为副军长兼政委，事实上项英实际掌控军队。新四军编入第三战区战斗序列（指挥官顾祝同），并规定在苏北、皖南地区担任游击。
然而国共两党表面上达成的合作并不代表真正的和平，双方矛盾冲突不断。毛泽东坚持要求部下“不受国民党的限制，超越国民党所能允许的范围，不要别人委任，不靠上级发饷，独立自主地放手地扩大军队，坚决地建立根据地”。1940年4月15日，毛泽东、王稼祥电令项英、刘少奇发动黄桥事件夹击国民革命军韩德勤的部队。
为避免双方接触继续冲突，从维护抗战大局出发，1940年10月19日，何应钦、白崇禧以国民政府军事委员会名义，强令新四军、八路军必须在一个月内全部撤到旧黄河河道以北之冀察两省和晋东北及冀鲁交界地区。毛泽东起初置之不理，之后却同意新四军过江。
过江有两条路，一条直端端北上，渡口在皖东的繁昌、铜陵，另一条朝东南方向走，在长江下游江苏南部的镇江渡江。12月10日，蒋介石规定项英走皖东路，因为镇江一带国民党韩德勤部正在和新四军打仗，他怕项英部队去参战。他给名义上是项英上级的国民党长官顾祝同发电报说：“查苏北匪伪不断進攻韩部，为使该军江南部队，不致直接参加对韩部之攻击，应不准其由镇江北渡，只准其由江南原地北渡”。
毛泽东起初同意蒋介石的调配方案，对项英说：“同意直接移皖东、分批渡江”。但是第二天，毛突然打电报要项英改走蒋介石特地否决的苏南路线：“走苏南为好。”中共方面认为国民党规定的直接北渡方案是阴谋，皖南新四军最终坚持走东进再由苏南北渡的路线。
路线的改变，是造成皖南事变最初的火星。毛泽东此事并没有通知蒋介石，蒋介石还以为项英会按他的要求走皖东，于1941年1月3日发电报给新四军军长叶挺，重申皖东路线，并说他“沿途已令各国民党军掩护。”
项英此时发现，蒋介石并不知道路线的改变，于是赶紧在4日电报蒋介石给予通知。
中共将领与蒋介石的联系必须经过毛泽东，再由周恩来转发。所以这封项英给蒋介石的电报事实上在毛泽东这里就被扣押了。毛泽东在1月13日给重庆周恩来的电报里说：“军机前转上叶、项支[四]日致蒋电，措词不当，如未交请勿交。”
后果可想而知。4日晚风雨交加，项英和一万新四军進入了国民党十几万大军的驻扎区。这些军队没有得到项英要过路的通知，以为是新四军来挑衅，就开了火。由于黄桥之战的仇恨，顾祝同下令把项英的部队“彻底加以肃清”。
皖南事变爆发了。
项英立刻向延安发电报要求毛泽东与国民党交涉，一直没回应。9日，新四军江北指挥部刘少奇电毛谈起项英的情况，毛泽东却说并不知情。
6日到9日，毛真的没有接到过项英的电报？可是刘少奇都收到了，为何毛泽东没收到？真是没收到，为什么不设法恢复联系，在这样重要的时刻？这一系列问题都表明此事并不简单。
可以做出大胆猜测，由于与项英之前的矛盾，毛泽东便借蒋介石之手除掉项英这个心腹之患。同时，毛泽东在13日对此事大做文章“向全国呼吁求援”，并向苏联告状，称蒋介石计划全歼新四军，然后消灭八路军，以此要求斯大林出兵帮他。然而苏联方面并不同意此时国共内战，因为苏联希望中国牵制日本兵力以免苏联东西两线开战。
皖南事变后，中共开动宣传机器，而国民党却担心内战消息影响国内抗战士气和国际援助默不吭声。于是人们都以为皖南事变是国民党屠杀无辜共产党人的一场内战，而事实真相却被掩藏在历史尘埃之中。除掉了竞争对手项英，而且在舆论上占领优势地位，毛泽东这一招真可谓是一箭双雕。